Human microorganisms and inflammatory immunology pathology and systemic infections (MiBioPath Group)

• Biología Molecular de Microorganismos

Análisis de la microbiota intestinal en muestras corporales (heces, sangre) mediante método de secuenciación masiva del DNA bacteriano:
Mediante pirosecuenciación V3V4 de la región del gen ARNr 16S, se realiza una amplificación del mismo usando las secuencias clave bacterianas (primers). La muestra resultante es posteriormente lavada, cuantificando los fragmentos del ADN obtenidos mediante el autoanalizador PicoGreen (Quant-iT, PicoGreen DNA assay, Invitrogen). Finalmente, el amplicón resultante es enviado para la final pirosecuenciación en servicios externalizados donde el estudio EmPCR es realizado y se obtienen los resultados de toda la muestra mediante la base de datos ?454 Life Sciences GS FLX+ instrument (Roche)? y la de ?Roche Amplicon Lib-L protocol?.


• Inmunoquímica

Análisis de TNF alfa, IFN gamma e interleuquina (IL) 1B e IL6:
Los análisis de interleuquinas, TNF e Interferón gamma se realizan en muestras de sangre periférica, utilizando una placa lectora de ELISA y un lavador automático de placas.


• Biología Molecular

Análisis de la translocación bacteriana de origen intestinal:
Aislamiento del DNA de una muestra de suero con el kit ?QIAmp DNA Blood Mini Kit" (QIAgen, Hilden, Germany) y su ulterior amplificación mediante técnica de PCR de fragmentos del gen ARNr 16S


• Análisis Bioquímico

Permeabilidad intestinal:
Estudio mediante dos trazadores que controlan tanto los factores pre- como post-mucoso no relacionados con la actividad ni la integridad de la mucosa intestinal. El control de estos factores mejora la sensibilidad y especificidad de la prueba y facilita su interpretación. Además, administrar los dos trazadores simultáneamente por boca permite expresar y cuantificar su excreción urinaria cuantificando esta.
La prueba consiste en administrar, tras un ayuno nocturno, una solución de 100 ml de agua que contenga 18.2 gramos de manitol y la misma cantidad de lactulosa. Se recolecta la orina de las 5 horas siguientes a la toma. Las determinaciones analíticas de las muestras de orina se realizan en los autoanalizadores del laboratorio ubicado en la UCAM.


• Inventario equipo 6 del grupo 7 con código origen 07018314

Material (Kits) para separación DNA:
- centrífuga de mesa
- termo bloque con agitación

Amplificación DNA:
- termociclador
- casting electroforesis horizontal + fuente alimentación
- sistema de foto documentación

Secuenciación DNA:
- externalización del servicio para realizar con secuenciador

Detección citosinas:
- lector de placas ELISA. Kits para el proceso de las pruebas.
- lavador automático de placas ELISA (opcional, aunque aconsejable)

Material adicional:
- micro pipetas 1000, 200, 20 y 10.
- material plástico de laboratorio (tubos eppendorf, puntas con filtro, etc.)

-Estudio de la permeabilidad intestinal mediante el test del manitol/lactulosa:

-Pirosecuenciador para secuenciación masiva en muestras biológias y tejido de biopsia. Actualmente la extracciobn del DNA de las muestras se realiza en los laboratorios de la UCAM preparados para ello. La posterior fase hasta el análisis bioinformático se realiza externalizando la prueba mediante concierto de colaboración científica de nuestro grupo pero por personal propio del grupo hasta poder disponer el grupo de la tecnologia propia para lectura de primers, montaje de librerías y análisis bioinformático de los resultados.